История театра в Новочеркасске началась в 1825 году. В фонде Войсковой канцелярии войска Донского, хранящемся в государственном архиве Ростовской области, есть запись: «С 1825 г. заведен в Новочеркасске небольшой театр, на коем играет приезжающая сада разновременно из Таганрога труппа актеров».
Путь многих именитых артистов прошел через сцену театра Войска Донского. Один из основателей Московского художественного театра В. И. Немирович-Данченко сказал: «Новочеркасский театр был одним из лучших в России».
В августе 1893 в состав театра была принята Вера Федоровна Комиссаржевская, будущая «Чайка» русской сцены.
В первую годовщину смерти А. П. Чехова (1905) городской зимний театр показал новочеркасцам спектакли по его пьесам «Дядя Ваня» и «Вишневый сад», пьеса «Чайка» была поставлена в Новочеркасске в 1896 году (почти на 2 года раньше, чем на сцене Московского художественного театра). В Новочеркасске играли «Чайку» с рукописи, переписанной с тетради А. П. Чехова.
В июне 2011 года оргкомитетом премии «Лучшее предприятие России» Донской театр драмы и комедии им. В. Ф. Комиссаржевской был включен в список «100 лучших предприятий РФ» и отмечен почетным дипломом победителя всероссийского конкурса в номинации «Лучшая организация культуры и отдыха».
В 2017 году театр был включен в национальный реестр ведущих учреждений культуры России. В 2019 году детская театральная студия «Мастер-класс» завоевала серебряную медаль на «Дельфийских играх».
